Diagnostyka prenatalna zespołu hiper-IgM związanego z chromosomem X. ad

Dodatkowe informacje kliniczne na temat zmarłych członków niektórych rodzajów zostały uzyskane z dokumentacji medycznej. Próbki krwi obwodowej uzyskano po tym, jak pacjenci wyrazili pisemną świadomą zgodę, a genomowy DNA przygotowano jak opisano w innym miejscu16. Analiza prenatalna
Próbkowanie kosmówkowo-kosmówkowe wykonano za pomocą biopsji przezbrzusznej w 12 tygodniu ciąży. Analiza karyotypiczna została przeprowadzona zgodnie ze standardowymi metodami, 17 i genomowe DNA wyizolowano jak opisano w innym miejscu16.
Pisanie mikrosatelitarne
Próbki genomowego DNA od 36 zdrowych, niepowiązanych kobiet zastosowano do określenia częstotliwości heterozygotyczności18 powtórzenia dinukleotydu liganda CD40. Wybrano sekwencje przednich 5 CTTCTCAATCCCCTTTC3 i odwrotnych 5 CATCCCTACTCCTCACC3 , które flankują powtórzenia cytozyny i adeniny (CA) cDNA liganda CD40. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) została przeprowadzona w objętości 25 mikrolitrów z 100 ng genomowego DNA, 3 pmol przedniego startera (znakowanego końcowo [32P] gamma-ATP), 3 pmol nieznakowanego przedniego startera, 6 pmol nieznakowanego startera odwrotnego i 0,5 U polimerazy Taq w buforze zawierającym 0,4 mM trifosforany deoksynukleotydu, 1,5 mM chlorek magnezu, 50 mM chlorek potasu, 10 mM kwas Tris-chlorowodorowy (pH 9) i 0,1 procent Triton X-100. Po początkowym cyklu denaturacji w 94 ° C przez pięć minut, przeprowadzono 27 cykli denaturacji w 94 ° C przez jedną minutę, hybrydyzacji w 54 ° C przez jedną minutę i wydłużania w 73 ° C przez jedną minutę. Produkty analizowano na 5 procentach denaturujących żeli poliakryloamidowych, a częstotliwość różnych alleli określano po tym, jak wysuszone żele poddano autoradiografii.
Mutacyjna analiza genu Ligand CD40
CDNA uzyskano po odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA wyekstrahowanego z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej stymulowanych estrem forbolu i jonomycyną19. Transkrypty ligandu CD40 amplifikowano przez zagnieżdżoną PCR i sekwencjonowano bezpośrednio jak opisano w innym miejscu10. W celu określenia genotypu płodu, syntetyzowano startery oligonukleotydowe otaczające dotknięty region genomowy za pomocą danych sekwencji uzyskanych z klonu genomowego liganda CD40 (dane niepublikowane). Amplifikowane DNA następnie sekwencjonowano bezpośrednio jak opisano w innym miejscu10.
Wyniki
Powtarzalność mikrositeli ligandu CD40
Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka powtórzeń mikrositeli ligandu CD40. Klonowanie molekularne ludzkiego ligandu CD40 ujawniło obecność przedłużonego powtórzenia dinukleotydu (CA) 32 w 3 nieulegającym translacji regionie cDNA8. Takie proste powtórzone sekwencje DNA, sklasyfikowane jako powtórzenia mikrosatelitarne, są szeroko rozpowszechnione w genomie ssaka 20, ponieważ wzbudzają zainteresowanie ze względu na wysoki stopień polimorfizmu, a tym samym swoją użyteczność jako markerów genetycznych20. Aby określić, czy powtórzenie CA40 ligandu CA jest polimorficzne, startery oligonukleotydowe po każdej stronie powtórzenia zastosowano do amplifikacji genomowego DNA od 36 niespokrewnionych, zdrowych kobiet za pomocą PCR. Powtórzenie ligandu CD40 okazało się polimorficzne i pouczające (Tabela 1). Wykryto osiem alleli, dla heterozygotyczności wynoszącej 0,79 (tj. 80 procent kobiet miało dwa różne allele)
[patrz też: dermotan cena, test inteligencji emocjonalnej golemana, przeglądarka skierowań do sanatorium ]

Powiązane tematy z artykułem: dermotan cena przeglądarka skierowań do sanatorium test inteligencji emocjonalnej golemana